STUDI CON VOLONTARI CHE RIMPIAZZANO GLI ANIMALI NEGLI ESPERIMENTI SUL CERVELLO

Relazione e suggerimenti dei volontari nella ricerca e nelle sedute di test

Gill Langley (1), Graham Harding (2), Penny Hawkins (3), Anthony Jones (4), Carol Newman (1), Stephen Switheneby (5), David Thompson (6), Paul Tofts (7) and Vincent Walsh (8)

Introduzione
La legislazione nazionale ed europea prevede la sostituzione, la riduzione e il miglioramento degli esperimenti su animali dove possibile, dando la responsabilità agli scienziati di attuare questi concetti nella pianificazione, progettazione e approvazione e nel modo di condurre le ricerche.
Ci sono state alcune discussioni sul ruolo degli studi sui volontari umani nella sostituzione e riduzione degli esperimenti su animali. In seguito alla conferenza tenutasi a Birmingham, Gran Bretagna, nel 1995, è partita l’iniziativa chiamata “Volontari nella ricerca e nei test”, che esplora il potenziale di studi etici su volontari come alternativa agli esperimenti su animali. Come parte di questa iniziativa, nel novembre 1998 si è tenuto un seminario per studiare il campo della ricerca sul cervello.
Durante gli anni ’90 lo sviluppo delle moderne tecniche di imaging ha aperto nuove finestre sul cervello umano, rivoluzionando la ricerca e permettendo studi che prima non erano possibili. I metodi di imaging offrono una visione dall’interno della struttura del cervello e delle sue funzioni a livello delle cellule e degli apparati, e uno dei loro punti di forza è che permettono una visione più globale ed integrata del cervello umano.
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Ricerche sul cervello su animali
Nel 1998 (4), 45.992 procedure su animali (i due terzi delle quali su ratti) condotte in Inghilterra prevedevano interventi sul cervello. […] Nonostante ratti e topi fossero gli animali usati più frequentemente, altre specie venivano usate, fra cui altri roditori, conigli, gatti, cani, furetti, ungulati, scimmie, uccelli, rettili, anfibi e pesci.
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Quali sono gli interrogativi nella ricerca sul cervello sugli animali e quali risposte si ottengono?
I campi della ricerca su animali presi in considerazione durante il seminario includevano: studi sulle funzioni cognitive (come la memoria, l’apprendimento, l’attenzione); funzioni sensoriali (ad esempio dolore, vista, udito, e gusto) e attività motorie (ad esempio minzione, deglutizione e movimenti delle braccia) e integrazione senso –motoria; duttilità cerebrale e riassetto (ad esempio dopo un trauma); patologie cerebrali (come ictus, sclerosi multipla, Parkinson ed epilessia); e la produzione di sostanze da parte del sistema nervoso centrale (incluso la predisposizione alle droghe, la barriera emato-encefalica, il metabolismo della sostanza, la conduzione dei recettori, efficacia e tossicità); oppure studi post marketing (o di fase IV°: dopo la commercializzazione della sostanza ndt) sulla sostanza.

Quali interrogativi vengono posti nella ricerca su animali?
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La stimolazione e la registrazione tramite elettrodi sono usate per localizzare ed esplorare la funzione di aree attive del cervello o di singoli neuroni. […]
Tecniche lesive fra cui gli elettrodi, l’aspirazione o le neurotossine sono usate per localizzare funzioni in aree specifiche del cervello. […]
Il tracciante fluorescente o altri traccianti sono usati in vivo negli animali per identificare connessioni anatomiche nel cervello, a livello di singole fibre o fasci di fibre. […]
Metodi biochimici e farmacologici sono applicati a studi cognitivi, sensoriali e motori su animali, così come nella ricerca di disfunzioni cerebrali e produzione di sostanze. […]
Negli esperimenti su animali la distribuzione topografica, cellulare e subcellulare dei recettori può essere studiata iniettando anticorpi specifici per i recettori e analizzando la marcatura degli anticorpi nel tessuto cerebrale post – mortem (10). […]
Le tecniche della formazione d’immagini e tecniche correlate come la spettroscopia a risonanza magnetica, la risonanza magnetica, la PET e la SPECT sono usate anche negli studi su animali, non solo in neurochimica e neurofarmacologia, ma la maggior parte sono affrontati nel modo descritto sopra.

Quali risposte forniscono gli studi su animali?
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Con l’avvento di tecniche di imaging non invasive, che rende possibile lo studio del cervello umano con una risoluzione di pochi millimetri, il punto di forza della ricerca su animali può essere identificato nella ricerca a livello della singola cellula. […]
In più, nel caso della ricerca medica più che in quello della ricerca di base, il grado di precisione degli studi su animali può essere superfluo, posto che i risultati non sono trasferibili in modo attendibile all’uomo, a causa della differenza di specie.
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Un caso indicativo è quello della sclerosi multipla, dove gli esperimenti su animali suggerivano un quadro relativamente semplice di demielinizzazione che causa invalidità. Gli studi con le tecniche di imaging su pazienti con sclerosi multipla hanno adesso rivelato una complessità maggiore: la rimielinizzazione può avvenire e la morte assonale può giocare un ruolo importante (11). […]

Possono gli studi sull’uomo con le tecniche di imaging e metodi correlati procurare già dati equivalenti in alcune aree della ricerca sul cervello e se sì, quali?

Funzioni cognitive
Nel campo degli studi cognitivi, la ricerca su volontari ha enormi potenziali nel rimpiazzare gli esperimenti su animali. […]
Gli esperimenti di registrazione e stimolazione con microelettrodi identificano l’ubicazione e la funzione di aree specializzate nelle scimmie, ma c’è un dibattito sulla collocazione e anche sull’esistenza di queste aree negli esseri umani. Susan Courtney e i suoi colleghi usano la risonanza magnetica funzionale per investigare l’ubicazione dell’area della memoria spaziale nell’uomo (12). […]
Nel campo della psicologia cognitiva, la maggior parte degli studi animali basati sulla lesione di specifiche aree cerebrali e molti studi basati sull’attivazione tramite elettrodi impiantati di aree o circuiti cerebrali specifici possono essere rimpiazzati da studi su umani con la TMS (stimolazione magnetica transcraniale ndt), e questo metodo di lavoro è già ben avviato. La TMS può essere usata per creare “lesioni” di breve durata e reversibili nel cervello dei volontari umani. […]
Nonostante la TMS non penetri le strutture più profonde e non abbia un’alta risoluzione spaziale, questa lacuna può essere ovviata combinando la TMS con altre tecniche di imaging (figura 1).
[…] Questo è stato il primo studio che ha dimostrato le condizioni di comportamento negli esseri umani che si trovano sotto rilascio di dopamina e ha illustrato l’abilità della PET nel rivelare i flussi neurotrasmettitori nell’attività del cervello umano.
[…] In futuro, l’interrogativo al quale si dovrà rispondere è se sia eticamente accettabile verificare dati relativi all’uomo tramite studi con elettrodi su animali; i partecipanti al seminario conclusero che non era accettabile.
[…] Gli scienziati statunitensi hanno sviluppato un metodo a risonanza magnetica che traccia la direzione della più veloce propagazione d’acqua, delineando in questo modo le traiettorie delle fibre (15). […]
I partecipanti al seminario hanno concluso che gli studi sull’uomo sono possibili e appropriati per studi in psicologia sia a livello di apparati che a livello globale. […] La maggior parte dei partecipanti sentiva che gli studi sull’uomo potevano di fatto fornire tutti i dati necessari in questo campo.

Funzioni sensorie e motorie
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Come in una figura, negli studi di elaborazione di immagini, le scansioni prodotte dalla Risonanza Magnetica Funzionale forniscono un substrato anatomico per la localizzazione funzionale di dati NON visivi prodotti da altre tecniche diagnostiche quali la MEG e l’EEG. Con la MEG la sequenza cronologica di attivazione di differenti aree del cervello può essere seguita in tempo reale nell’ordine di millisecondi, replicando la sensibilità temporale degli esperimenti su animali.
[…] La TMS è usata per stimolare un’area del cervello con una funzione conosciuta; le connessioni, alcune delle quali possono non essere state scoperte con l’elettrofisiologia su animali, sono attivate e possono quindi essere visualizzate come incrementi nel flusso sanguigno cerebrale usando la PET. […]
Le macchine di fMRI capaci di produrre un forte campo magnetico hanno una buona risoluzione spaziale, e le attrezzature più potenti sono in grado di distinguere le colonne (di neuroni) di dominanza visiva. […]
Le analisi di post mortem del tessuto cerebrale umano possono anche contribuire alla comprensione di struttura e funzione. L’ossidasi istochimica del citocromo è stata usata per studiare l’organizzazione modulare della corteccia visiva umana extra-striata, confrontando i modelli dell’ossidasi citocromica (una misura dell’attività del metabolismo locale) nel normale cervello post mortem e nel cervello di pazienti con degenerazione maculare (21). […]

Plasticità e riparazione
Nei volontari che soffrono di lesioni cerebrali, amputazione di arti o ictus, la scansione simultanea con PET e TMS permette di studiare come il cervello si riorganizzi e come procede la riabilitazione. […] Combinando la TMS con la PET o con la risonanza magnetica funzionale si possono identificare le nuove vie nervose usate dal cervello.
La TMS è stata usata anche in combinazione con la stimolazione sensoriale per studiare la plasticità corticale nei volontari. […]
A volte i cambi della plasticità possono essere misurati nei cervelli umani post mortem oppure nelle prove bioetiche. […]

Patologia cerebrale
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Le tecniche di risonanza magnetica possono essere usate con i pazienti per studiare la patofisiologia e la biochimica che stanno alla base di numerosi disturbi, incluso l’ictus, l’epilessia, la sclerosi multipla, gli effetti neurologici associati all’HIV, i tumori cerebrali, i traumi cerebrali e le malattie del metabolismo.
Le ricerche sull’ictus e l’ischemia cerebrale hanno utilizzato ratti, gerbilli e scimmie, ma le lesioni prodotte potevano essere differenti da quelle nell’uomo. E’ sempre più praticabile studiare l’ictus nei pazienti utilizzando i parametri di misura della risonanza magnetica, per esempio la permeabilità capillare del cervello, il volume interstiziale e il tempo medio di trasporto del flusso sanguigno.
Per molti anni l’encefalomielite allergica è stata il modello animale standard di sclerosi multipla, ma non è molto rappresentativo della patologia della malattia umana. […]
Usando la SPECT con un legante che fissi le aree trasportatrici di dopamina, un esperimento ha testato l’ipotesi che pazienti con depressione avessero una più bassa densità di vettori di dopamina nei gangli basali (26). […]
La SPECT, co-registrata nello spazio con la risonanza magnetica, era usata per misurare il flusso sanguigno cerebrale nei pazienti epilettici che soffrivano di vomito ittale (27). […]
Gli studi con la PET sul Parkinson nei volontari (28) hanno usato vari leganti radiomarcati per visualizzare il deficit dopaminergico a livello pre-sinaptico, per misurare le zone di risollevamento di dopamina negli stadi precoci e avanzati della malattia e per dimostrare che la sostanza selegiline inibisce l’ossidasi – B monoamine nella corteccia.
La spettroscopia a risonanza magnetica fornisce dei mezzi non invasivi di misurazione della distribuzione e concentrazione di diversi marcatori di neuroni e cellule gliali e li mette in relazione con la funzione cerebrale umana in condizioni di salute e di malattia. […]

Sviluppo di sostanze e indagini relative
Le tecniche di imaging del cervello umano possono essere di immenso valore anche nello sviluppo di sostanze del sistema nervoso centrale […].
I sotto-tipi recettoriali, gli enzimi e i neurotrasmettitori trasportatori, possono tutti essere ricettori di sostanze per il trattamento di disturbi psichiatrici e neurologici.
Gli studi con le tecniche di imaging su volontari può ridurre la gamma e la durata (e di conseguenza anche i costi) delle prove di sostanze sul sistema nervoso centrale, così come ridurre gli esperimenti su animali. […] Individuando le sostanze candidate più promettenti, questi studi ridurranno il numero di test su animali. […]
Si può risalire alle dosi ottimali per le prove cliniche sulla base delle misurazioni di conduzione del recettore stabilite dalla PET, raggiungendo un equilibrio tra gli effetti benefici e gli effetti collaterali. Questo può facilitare le prove cliniche, così come ridurre gli studi pre-clinici su animali.
[…] Nello sviluppo degli inibitori encefalinasi, una sostanza candidata era molto efficace sui roditori (31), ma non sembrava essere efficace come analgesico sull’uomo. […]
[…] Un caso indicativo fu uno studio in cui si dovevano misurare i livelli di sostanza inibitrice della fame, la desfenfluramina, nei cervelli di pazienti che erano stati trattati clinicamente per l’obesità (32). I test su animali avevano indicato che alti livelli della sostanza causavano cambiamenti neurochimici irreversibili,ma usando la spettroscopia a risonanza magnetica con un legante radiomarcato si dimostrò che questi livelli non venivano raggiunti nel cervello dell’uomo.

Quali interrogativi vengono posti dagli studi sull’uomo e quali sono le risposte ottenute?
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I soggetti umani vengono istruiti più facilmente per perseguire vari obiettivi: ci possono volere mesi per istruire una scimmia, così gli studi sull’uomo possono essere più veloci. […]
Le tecniche di imaging sul cervello umano hanno fornito nuove informazioni globali sulle strutture integrate, e hanno identificato aree di insospettata rilevanza, che hanno portato alcuni campi di ricerca oltre la portata degli studi su animali. […]
La PET e altre tecniche di imaging hanno identificato le aree umane chiave coinvolte nel processo del dolore e le interazioni fra loro, ad esempio nei dolori reumatici. […]
Le tecniche di imaging sui pazienti possono fornire vantaggi scientifici maggiori rispetto allo studio di malattie riprodotte sul modello animale. […]

Quali sono i limiti attuali agli studi su animali e quali sono le prospettive per superarli?
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Usando la PET una specifica area funzionale del cervello può essere identificata con un forte captazione tracciante che contrasti con un basso captazione nel tessuto circostante. […]
È emersa una nuova tecnica grazie alla quale ai pazienti con cecità corticale venivano impiantati piccoli impianti con elettrodi nella corteccia visiva. Dopo più o meno un mese i dendriti facevano contatto con gli elettrodi e ne derivavano sensazioni visive. Con uno sviluppo ulteriore è probabile che questo approccio produca nuove intuizioni sulla micro architettura del cervello umano.
Con gli studi sull’uomo sorgono nuove barriere etiche e di parametri di sicurezza che non verrebbero prese in considerazione da molti scienziati negli studi su animali. […]

Limiti imposti dalla cultura della ricerca
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A volte i risultati delle tecniche di imaging applicate all’uomo generano nuove ipotesi che sono già state testate sugli animali semplicemente perché questi vengono sempre usati per validare le scoperte fatte sull’uomo.

LEGENDA
MEG: Magnetoencefalogramma
PET: Tomografia ad emissione di positroni
SPECT: Tomografia computerizzata ad emissione di singoli fotoni
TMS: Stimolazione magnetica transcraniale